高效毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)

　　柱效高，可達(dá)105～106/m

　　分離速度快，幾十秒～幾十分鐘

　　溶劑和試樣消耗極少

　　沒(méi)有高壓泵，儀器成本比HPLC更低

　　選擇性強(qiáng)

毛細(xì)管電泳的發(fā)展

　　1807～1809年，俄國(guó)物理學(xué)家F.F.Reuss首次發(fā)現(xiàn)黏土顆粒的電遷移現(xiàn)象。

　　1907年，F(xiàn)ield和Teague首次用電泳成功分離了白喉毒素和它的抗體。

　　1937年，瑞典科學(xué)家將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端加電壓，第一次分離出白蛋白和a、b、g-球蛋白。 Tiselius還制成了第一臺(tái)電泳儀并進(jìn)行了第一次自由溶液電泳。他因?qū)﹄娪炯夹g(shù)的發(fā)展和應(yīng)用的巨大貢獻(xiàn)而獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。自由溶液電泳的分離效率受焦耳熱的限制，只能在低電場(chǎng)強(qiáng)度下進(jìn)行操作，使分析時(shí)間和分離效率很低。

　　1967年，Hjerten最早提出了用小內(nèi)徑管在高電場(chǎng)下進(jìn)行自由溶液的電泳。

　　1981年，Jorgenson和Luckas發(fā)表了劃時(shí)代的研究工作，用75um內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳，電遷移進(jìn)樣，熒光柱上檢測(cè)丹?；被?，達(dá)到400000塊/m理論塔板數(shù)的高效率。從此跨入高效毛細(xì)管電泳的時(shí)代。

　　1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜。

　　1987年Hjerten建立了毛細(xì)管等電聚焦,Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。

　　1988～1989年出現(xiàn)了第一批毛細(xì)管電泳商品儀器。短短幾年內(nèi),由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)多肽、蛋白質(zhì)(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求,得到了迅速的發(fā)展。CE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。

毛細(xì)管電泳法和其他分析方法的區(qū)別

　　毛細(xì)管電泳法和高效液相法的區(qū)別

　　CE和高效液相色譜法(HPLC)相比,其相同處在于都是高效分離技術(shù),儀器操作均可自動(dòng)化,且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時(shí)間取代HPLC中的保留時(shí)間,CE的分析時(shí)間通常不超過(guò)30min,比HPLC速度快；對(duì)CE而言,從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比,對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言,其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級(jí),最低可達(dá)270fl,流動(dòng)相用量也只需幾毫升,而HPLC所需樣品為μl級(jí),流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實(shí)現(xiàn)微量制備,而HPLC可作常量制備。

　　毛細(xì)管電泳法和普通電泳法的區(qū)別

　　CE和普通電泳相比,由于其采用高電場(chǎng),因此分離速度要快得多；檢測(cè)器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外,其它類型檢測(cè)器均已和CE實(shí)現(xiàn)了連接檢測(cè)；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動(dòng)化程度比普通電泳要高得多?？傊?CE的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少：高靈敏度,常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13～10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-19～10-21mol；高分辨率,其每米理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn)；高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至千萬(wàn),而HPLC一般為幾千到幾萬(wàn)；高速度,最快可在60s內(nèi)完成,在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì),1.7min分離19種陽(yáng)離子,3min內(nèi)分離30種陰離子；樣品少,只需nl(10-9L)級(jí)的進(jìn)樣量；成本低,只需少量(幾毫升)流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力,使CE成為近年來(lái)發(fā)展最迅速的分離分析方法之一。當(dāng)然CE還是一種正在發(fā)展中的技術(shù),有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開(kāi)發(fā)。

毛細(xì)管電泳的分類

　　按填充物質(zhì)的性狀

　　自由溶液電泳和非自由溶液電泳。

　　按分離機(jī)制分類

　　電泳型、色譜型、電泳/色譜型

　　主要分離模式

　　毛細(xì)管區(qū)帶電泳

　　膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳

　　微乳液電動(dòng)毛細(xì)管色譜

　　毛細(xì)管凝膠電泳

　　毛細(xì)管等電聚焦

　　毛細(xì)管電色譜

　　非水毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳理論

　　電泳和電泳淌度

　　電泳：在電場(chǎng)作用下帶電粒子在緩沖溶液中的定向移動(dòng)

　　電滲和電滲率

　　電滲：液體相對(duì)于帶電的管壁移動(dòng)的現(xiàn)象

　　CE所用的石英毛細(xì)管柱,在pH>3情況下,其內(nèi)表面帶負(fù)電,和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。在高電壓作用下,雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲,粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和,正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致,故最先流出；中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反,但因電滲流速度一般都大于電泳流速度,故它將在中性粒子之后流出,從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。

　　電滲是CE中推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力,它使整個(gè)流體像一個(gè)塞子一樣以均勻速度向前運(yùn)動(dòng),使整個(gè)流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。但在HPLC中,采用的壓力驅(qū)動(dòng)方式使柱中流體呈拋物線型,其中心處速度是平均速度的兩倍,導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張,引起柱效下降,使其分離效率不如CE。

　　表觀淌度和權(quán)均淌度

　　分離效率和譜帶展寬

　?。ㄒ唬├碚撍搴退甯叨?/p>

　　同色譜

　?。ǘ┳V帶展寬

　　1. 流型

　　毛細(xì)管電泳——扁平型塞子流（高柱效）

　　高效液相——拋物線型

　　2. 自熱

　　電流通過(guò)緩沖溶液時(shí)產(chǎn)生的焦耳熱

　　自熱導(dǎo)致徑向溫度梯度，因而產(chǎn)生離子遷移速度的徑向不均勻分布，使譜帶展寬

　　管內(nèi)徑小，管外徑大，可減小自熱引起的溫度差

　　如：內(nèi)徑50um，外徑375um

　　EdC1/3<1500時(shí)，自熱不會(huì)引起太大的譜帶展寬和效率損失

　　3. 擴(kuò)散與吸附

　　擴(kuò)散：在毛細(xì)管電泳中，溶質(zhì)縱向擴(kuò)散是譜帶展寬的唯一因素

　　吸附：毛細(xì)管管壁對(duì)于被分離物質(zhì)粒子的作用

　　陽(yáng)離子溶質(zhì)和帶負(fù)電的管壁的離子相互作用

　　疏水作用

　　毛細(xì)管內(nèi)表面積和體積比越大，吸附的可能性也越大

　　分離度

毛細(xì)管電泳的主要分離模式

　　毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE

　　1. 操作電壓

　　柱長(zhǎng)一定時(shí)，操作電壓增加，粒子遷移加快，柱內(nèi)焦耳熱增加

　　在一定范圍內(nèi)柱效隨電壓的升高而升高，過(guò)了極點(diǎn)后，焦耳熱影響加劇，反而下降 n= ? spELd/2D

　　2. 緩沖溶液的種類

　　直接影響粒子的遷移和分離

　　要求：緩沖容量好、在檢測(cè)波長(zhǎng)處吸收低、自身淌度低、與等電點(diǎn)相差約1個(gè)pH單位、盡量用酸性

　　3. 緩沖溶液的pH

　　影響溶質(zhì)的電荷：pH低于溶質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，溶質(zhì)帶正電荷；反之，帶負(fù)電荷

　　引起電滲的變化：在高pH下，電滲很大

　　4. 緩沖溶液的濃度

　　濃度增加，離子強(qiáng)度增加，改善分離

　　濃度增加，電滲率降低，遷移時(shí)間延長(zhǎng)

　　濃度增加，導(dǎo)電的離子數(shù)增加，焦耳熱增加

　　膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜MECC

　　以膠束為假固定相的一種電動(dòng)色譜

　　在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑中的疏水基團(tuán)可形成膠束，溶質(zhì)因淌度和分配系數(shù)的不同而分離。

　　1. 膠束假固定相

　　表面活性劑：親水基+疏水基

　　疏水基：直鏈或支鏈烷烴

　　親水基：陽(yáng)離子、陰離子、兩性離子基團(tuán)

　　2.基本原理

　　增加了帶電離子膠束相，其具有與周圍介質(zhì)不同的淌度，并且可以與溶質(zhì)互相作用

　　導(dǎo)電的水溶液相是分離載體的溶劑

　　3.流動(dòng)相

　　改變流動(dòng)相來(lái)調(diào)節(jié)選擇性

　　毛細(xì)管凝膠電泳CGE

　　將平板電泳中的凝膠用到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行電泳，不同體積的溶質(zhì)分子在起“分子篩”作用的凝膠中得以分離。

　　常用凝膠：聚丙烯酰胺、葡聚糖、瓊脂糖等

　　應(yīng)用：蛋白質(zhì)、核苷酸、RNA、DNA片段分離和測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物分析等等

　　毛細(xì)管電色譜CEC

　　將高效液相色譜中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管（或涂漬、鍵合到管壁），以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)制，以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的色譜過(guò)程稱為毛細(xì)管電色譜。

　　具有高效液相色譜的高選擇性

　　具有毛細(xì)管電泳的的高效性

　　毛細(xì)管柱類型：填充柱、開(kāi)管柱

　　非水毛細(xì)管電泳NACE

　　非水（有機(jī)溶劑）體系中進(jìn)行的毛細(xì)管電泳

　　在有機(jī)溶劑中加入電解質(zhì)使之具有一定的導(dǎo)電性才能實(shí)現(xiàn)NACE，酸及其銨鹽是最常用的電解質(zhì)

　　與水體系相比可承受更強(qiáng)的電場(chǎng)，在不增大焦耳熱的條件下可提高溶液中離子的濃度或增大毛細(xì)管內(nèi)徑

毛細(xì)管電泳的儀器組成

　　基本結(jié)構(gòu)：高壓電源、進(jìn)樣、填灌/清洗、毛細(xì)管、溫度控制、檢測(cè)、記錄/處理

　　高壓電源

　　電源：0～?30 kV直流高壓電源

　　電極：鉑絲或注射器針頭

　　電極槽：帶螺帽的小玻璃瓶或塑料瓶（1～5ml）

　　毛細(xì)管柱

　　化學(xué)惰性、電惰性，可以透光

　　聚四氟乙烯、玻璃、石英

　　內(nèi)徑25～75um，管長(zhǎng)<70cm

　　沖洗和平衡

　　進(jìn)樣

　　毛細(xì)管直接與樣品接觸，用動(dòng)力驅(qū)動(dòng)樣品進(jìn)入毛細(xì)管，無(wú)死體積

　　1. 電動(dòng)進(jìn)樣

　　組分在電場(chǎng)作用下，因電遷移和電滲作用進(jìn)入毛細(xì)管內(nèi)

　　對(duì)離子組分存在進(jìn)樣偏向

　　2. 壓力進(jìn)樣

　　將毛細(xì)管兩端置于不同的壓力環(huán)境中時(shí)，管中溶液即能流動(dòng)，將樣品帶入

　　無(wú)組分偏向，選擇性差

　　3. 擴(kuò)散進(jìn)樣

　　利用濃差擴(kuò)散，抑制背景干擾和進(jìn)樣偏向

　　檢測(cè)

　　1. 紫外檢測(cè)

　　2. 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)